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        DNA测序原理和基本技术之循环测序

        浏览次数: 日期:2015年1月19日 14:28

        1.基本原理  PCR技术能够快速、特异性地扩增靶DNA,应用PCR技术测定DNA序列分两个步骤:先利用PCR扩增靶序列片段,制备测序模板,然后再利用PCR直接测定序列。基于PCR原理的测序采用了热循环高效合成DNA的特性并结合双脱氧核苷酸终止法,使引物链终止的延伸产物数量在热循环过程中得到增加,因此称为循环测序。一个测序反应循环结束后,与延伸产物互补结合的靶DNA模板经过高温变性,可再成为单链模板引发引物链的退火、延伸与终止,产生高显影度的序列梯带。
        每个测序循环包括:①PCR扩增制备的模板DNA变性成单链形式;②标记引物与其中的一条链上的互补序列退火;③退火后的引物在耐热DNA聚合酶催化下发生链延伸终止反应。本次循环产生的模板链与延伸终止链形成的双链的产物,在下一轮测序循环中,再次被变性,释放出模板链,作为又一轮引发反应的模板,同时积累下每轮循环产生的链终止产物。上述循环步骤重复20~40次,使链终止产物以线性方式获得扩增。循环测序采用耐热DNA聚合酶,测序反应可以进行多次循环,因此循环测序是以双脱氧链终止法为基础的标准DNA测序方案,在方法学上是一个巨大的进步(如图所示)。
         


         
         
        2.基本技术循环测序反应利用了PCR,但是与普通PCR有两点不同。循环测序中,只需要一条引物,反应底物同时包括脱氧核苷三磷酸(dNTP)和双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)。其次,通过单引物进行循环扩增,模板DNA是以线性方式获得扩增(如图所示)。而不似标准PCR反应中以指数形式获得扩增。这种线性方式的扩增中,每一个引物延伸的分子在模板链对应碱基位置处终止,通过一定的检测技术得到终止碱基的信号。
         
        (1)模板与引物:测序模板是通过PCR制备的,PCR对靶DNA片段的要求不高,常规PCR扩增产物,经过纯化除去反应体系中残余的引物核苷酸和dNTP后即可作为模板。将制备模板的一个PCR引物经过标记后作为测序引物。对于已经克隆于M13噬菌体或质粒的靶片段,可以选用通用引物。
         
        (2)循环测序基本过程
         
        1)测序引物用r-32 P-dATP标记,实用引物浓度10~15pmol/L,dNTP浓度30umol/L,4种ddNTP浓度不同,在0.6~1.2mmol/L范围调整。测序模板0.1~0. 2pmol/L,测序反应缓冲液为500mmol/L Tris-HCI,pH8.8,加20mmol/L MgCI2,5u的Taq DNA聚合酶。
         
        2)热循环参数:94℃-lmin; 40--60℃-30s; 72℃延伸30s,共20~40个循环。
         
        3)循环反应结束后,加载样缓冲液,变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离。
         
        4)放射自显影,然后从电泳谱带读出DNA序列。

        所属类别: 法医物证

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