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        实时(定量)PCR之5'核酸方法(TaqMan)

        浏览次数: 日期:2015年1月20日 15:07

               TaqMan探针被波长不同的两种荧光染料标记(如图)。探针序列可与引物对之间特异的目的DNA区域杂交(Ong及Irvine,2002)。经典的探针设计是比PCR引物的退火温度稍高一些,这样探针可在PCR引物延伸前杂交。有时在TaqMan探针3’端使用一个小的凹槽粘接物,可使用更短的序列而具较高退火温度( Applied Biosystems,2003)。“报告”染料连接在探针的5’“淬灭”染料连接在3 ’端。常用FAM或VIC做报告染料,TAMRA为淬灭染料。当探针完整时,报告染料与淬灭染料接近,由于两种染料之间能量转移,报告染料的荧光被抑制,没有荧光信号。
         


               在聚合酶反应中,一开始链合成会去除杂交的TaqMan探针。Taq DNA聚合酶有5’核酸外切酶活性,酶切合成路径上的序列(与目标序列退火的探针)。当报告染料分子从探针上脱离下来,它不再接近淬灭染料,就可发出荧光(如图)。如果目标序列与探针互补,荧光信号会增强。

                某些方法,像Quantifiler试剂盒,包含内部PCR控制(IPC),用于证实聚合酶、检测方法和仪器正常情况。在这里IPC是一个标有VIC(绿色)的报告染料,与合成的模板杂交加入每一反应。检测目标区域的TaqMan探针被标记FAM(蓝色),能从绿色的VIC中辨别。像ABI Prism 7000序列检测仪还能使用其他染料,如ROX(红色),加入每一孔中去除背景吸收,调节孔间差异。

        所属类别: 扩增技术

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