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        聚合酶链式反应过程之微量(低水平)模板DNA的随机效应

        浏览次数: 日期:2015年1月22日 15:09

                法医DNA样本经常是微量的。当扩增微量模板DNA时,会发生一种被称为随机效应的现象。当只有少量的模板DNA分子参与PCR反应时,杂合子个体的两条等位基因被不均衡的扩增,这就是随机效应( Walsh et a1.,1992)。模板DNA低于约lOOpg或17个基因组DNA的双倍体时,PCR反应会出现等位基因缺失(Fregeau et a1.,1993;Kimpton et a1.,1994;Gill et a1.,2000)。如果等位基因中的一条没有被检测出来时,会出现假纯合子。通过调整反应的循环数目可以避免随机效应的问题,要得到成功的分型需约20或更多拷贝的目标DNA( Walsh et a1.,1992)。然而低拷贝(low-copy number,LCN) DNA的检测已有所研究(Gillet al., 2000,Gill et a1.,2002)。这一工作和小于lOOpg模板DNA的检验将在第七章论述。在PCR前的全基因组扩增和特异基因座扩增也存在同样的问题(Schneider et al.,2004;见D.N.A.解释4—1)。
        D.N.A.解释4-1
        全基因扩增
                法庭案件最常面临的挑战是恢复现场样本中有限的DNA。在过去的几年中,一项新的DNA富集技术得到发展,即全基因组扩增(WGA)。WGA使用的DNA聚合酶不同于Taq金牌酶。使用随机的六聚物作为引物点,扩增全基因组。WGA原理是多置换扩增( MDA)或称滚环扩增。MDA是等温300C孵育,不像PCR那样需要加热和冷却。Molecular Staging( New Haven ,CT)和Amersham Biosciences( Piscataway, NJ)提供
                ∮29DNA聚合酶混合物用于WGA. Molecular Staging的试剂盒是REPLI_gTM,AmershamBiosciences的试剂盒是GenomiPhjTM.Ing初始的DNA得到4—7ug扩增基因组DNA。∮29酶具有高处理能力,同时协调多头反应替补下游产物链,重叠环行扩增,可扩增大于lOkb的片段。而且它有3’-5’校对功能,复制的精确性比Taq酶更高。
                这些都使WGA有希望解决法医DNA样本受限的问题,不过,研究发现微量DNA模板的随机效应阻碍WGA的可靠性(Schneider et al.,2004)。如低拷贝数量DNA实验所见,在5~ 50pg的初始DNA实验中观察到了STR基因座的等位基因缺失( Schneider et al.,2004)。由于WGA富集低ng级DNA的能力有限,WGA不是解决低拷贝数目DNA样本的最终方法。

        所属类别: 扩增技术

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