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        实时PCR的不同相位与荧光强度对循环次数有关

        浏览次数: 日期:2015年1月22日 15:15

               PCR过程有三种不同的相位:几何学或指数扩增期、线性扩增期、平台期(Bloch,1991)。这些相位可以被看成是荧光强度对循环次数作图(图4-5)。在指数期具有高精确度。当反
        应接近100%的效率时,每一循环的产物倍增。循环数与DNA浓度的log值作图,得到指数期PCR扩增的线性关系。
               在指数期后的线性扩增期,由于一种或多种反应成分的消耗致使其浓度低于关键值,扩增效率变慢为数学增加而不是指数期的几何增加。由于像dNTP或引物这些成分在反应中消耗的速度略有不同,线性期样本间精确度差,不能用于比较。
               在PCR最终的平台期,多种成分消耗,产物的积累慢慢停止。在平台期观察到的荧光信号稳定了。在产物浓度接近10。7 mol/L时,反应趋于停止(Bloch,1991)。
               荧光强度与循环次数关系的最佳检测时期是指数期,产物量与加入的DNA的量关系较为一致。实时PCR使用循环阈值这一概念(CT)用于计算。CT是PCR扩增循环的一个点,荧光水平接近某一规定的阈值(如0.2),由软件在高于PCR开始阶段观测的噪音基线设定。达到荧光检测水平(超过软件设计的阈值)的循环数越少,加入PCR的起始DNA越多。DNA浓度的log值与CT做图,呈现负斜率线性关系(如图)。
         


               TaqMan探针的裂开或嵌入双链DNA分子的SYBR会使荧光信号增强。当与已知DNA浓度的样本比较时,荧光的增加与起始DNA含量相关。例如图,五个样本(a、b、c、d、e)依照CT值做一条标准曲线。表明样本间的一致性和精确性,一个未知含量的DNA样本可根据与标准曲线比较计算起始模板浓度。已有几种发表的实时PCR方法和出售的试剂盒,如Quantifiler人类DNA定量试剂盒

        所属类别: 扩增技术

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