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        聚合酶链式反应的DNA扩增过程

        浏览次数: 日期:2015年1月22日 15:35

        PCR是一种酶促反应,特定的DNA区域反复复制,产出大量特定序列的拷贝(Saiki et a1.,1988;Reynolds et a1.,1991)。这种分子“复印”过程涉及在30次以上的精确的温度循环,加热和冷却样本(图一)。在每一循环中,每一个目标DNA序列的拷贝都是由目标序列的每一个碱基复制而成的(图二)。与目标序列3’互补的寡核苷酸引物界定扩增产物的范围。
         


               在每一个循环中,两条DNA模板链先被加热分开(变性)。然后,样品被冷却到合适的温度(退火),寡核苷酸引物结合。最后,样品温度升高到一个优化的温度,DNA聚合酶使引物延伸,复制每一条模板。在每一循环中,DNA分子(两PCR引物间的序列)数目加倍

               理论上认为在30个循环以后,目的DNA产物接近10亿个拷贝(表1)。这些PCR产物有时被称为“放大”,这样可得到充足的产物,便于多种技术检测。详细内容见技术章节。
         
               CR通常使用的样本体系在5~lOOul之间。在如此小的体系中,蒸发和反应成分的精确吸量都是问题。另一方面,较大的体系会导致反应混合物的热平衡问题,外部温度改变后,大体系比小体系需要更长的时间将热量传递到溶液中心。因此,在每一温度需要更长的保留时间,整个温度循环时间也会加长。许多分子生物学PCR方法使用20~ 50ul的体系
         


        注:第三个循环后,PCR目标产物才能完全由引物对来确定。
                使用PCR热循环仪,样本加于反应管中。最普通的0.2ml薄壁管用于20~50ul的反应体系。带盖或不带盖的0. 2ml管或一排8连或12连管都可以买到。在大通量的实验室,96孔或384孔板被用于PCR反应。

               近年来出现的试剂盒简化了PCR。预制的PCR混合物包含扩增反应所需成分,法医DNA实验室仅需加入DNA模板即可。制造商的研究人员通过进一步研究优化这些试剂盒。试剂盒是特定设计的,使用者将特定量的基因组DNA加入试剂盒溶液。如果加入的模板DNA量在试剂盒设计范围内,将得到最佳结果。

        所属类别: 扩增技术

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